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免疫熒光實驗的步驟有哪些?

 更新時間:2023-10-18 點擊量:644

免疫熒光(IF)是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項檢測技術??捎糜跈z測和識別細胞和組織中蛋白質及其他分子的亞細胞分布和遷移。那么你知道免疫熒光實驗的步驟有哪些嗎?讓我們一起來看看吧!

一、細胞準備

對于單層生長的細胞,將細胞接種到預先處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,用PBS洗滌兩次。

對于懸浮生長的細胞,取對數(shù)生長的細胞,用PBS離心洗滌(1000rpm, 5min)兩次,然后用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

二、固定

根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌﹣砉潭毎?/p>

固定完畢后的細胞可置于含有疊氮納的PBS中,在4℃保存3個月。用PBS洗滌3次,每次洗滌5分鐘。

三、通透

對于使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定的細胞,一般需要在加入抗體之前進行通透處理,以確??贵w能夠到達抗原部位。選擇通透劑時應充分考慮抗原蛋白的性質。通透時間一般在5-15分鐘。通透后用PBS洗滌3次,每次洗滌5分鐘。

四、封閉

使用封閉液對細胞進行封閉處理,時間一般為30分鐘。

五、一抗結合

在室溫孵育1小時或者在4℃過夜。用PBST洗滌3次,每次沖洗5分鐘。

六、二抗結合

對于間接免疫熒光,需要使用二抗。在室溫避光孵育1小時。用PBST洗滌3次,每次沖洗5分鐘,然后再用蒸餾水洗滌一次。

七、封片及檢測

滴加一滴封片劑,然后封片,最后使用熒光顯微鏡進行檢查。

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