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CELLSCRIPT™體外加帽試劑盒工作原理

 更新時(shí)間:2022-03-04 點(diǎn)擊量:1849

CELLSCRIPT™的使命是提供安全高效的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品和技術(shù),用于制造和使用RNA以便進(jìn)行臨床研究和治療的細(xì)胞翻譯。

目前的產(chǎn)品包括多種體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、加帽類(lèi)似物或加帽酶的5' RNA加帽試劑盒和3' RNA多聚腺苷酸化的試劑盒,以及用于轉(zhuǎn)錄、加帽、poly(A)尾mRNA以進(jìn)行翻譯的多合一試劑盒。

其中,ScriptCap™ Cap 1 Capping System(C-SCCS1710)包含ScriptCap加帽酶、ScriptCap 2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶、GTP和SAM等成分,對(duì)體外轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加帽修飾。Cap 0或Cap 1上限均可構(gòu)建,效率接近100%(這不能通過(guò)共轉(zhuǎn)錄加帽方法來(lái)完成)。

ScriptCap加帽酶在體外催化具有5‘-三磷酸基的初級(jí)RNA的5’末端加成帽核苷酸。“帽核苷酸"或“帽"是一種鳥(niǎo)嘌呤核苷,它通過(guò)5‘C連接到一個(gè)三磷酸基團(tuán),然后再連接到初級(jí)mRNA轉(zhuǎn)錄本中最多的5’核苷酸的5‘碳上,在大多數(shù)真核生物中,帽核苷酸中鳥(niǎo)嘌呤7位的氮是甲基化的。表示為:m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')。其中m7G代表N7-甲基鳥(niǎo)嘌呤核苷,PPP代表帽子核苷的5’碳與初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本的第一個(gè)核苷酸之間的三磷酸橋,N1(PN)x-OH(3’)代表初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本,其中N1是最多的5’核苷酸。

ScriptCap加帽酶可依次催化三種不同的酶反應(yīng):

(1) RNA三磷酸酶將RNA的5‘三磷酸裂解成二磷酸:

pppN1(p)Nx-OH(3')——ppN1(pN)x-OH(3') + Pi

(2) RNA鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶將GTP連接到RNA最5‘核苷酸(N1)的5’二磷酸上:

ppN1(pN)x-OH(3') + GTP——G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + PPi

(3) 鳥(niǎo)嘌呤-7-甲基轉(zhuǎn)移酶以S-腺苷甲硫氨酸(SAM或ADOMet)為輔因子,催化帽核苷酸中鳥(niǎo)嘌呤7-氮的甲基化:

G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoMet——m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoHyc

這一過(guò)程被稱為“蓋帽",與未蓋帽的RNA相比,它提高了RNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。ScriptCap蓋帽酶構(gòu)建的封端RNA產(chǎn)物具有“0"帽結(jié)構(gòu)。在體外,通過(guò)同時(shí)使用ScriptCap 2‘-O-甲基轉(zhuǎn)移酶和ScriptCap蓋帽酶,可以將CAP0 RNA轉(zhuǎn)化為“CAP1"結(jié)構(gòu)。

ScriptCap 2‘-O-甲基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)將供體分子SAM上的甲基轉(zhuǎn)移到CAP 0 RNA倒數(shù)第二個(gè)核苷酸的2’-O位,從CAP 0-RNA制備CAP1-RNA,合成具有CAP 1結(jié)構(gòu)的RNA。

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Cap1 RNA可以進(jìn)一步提高mRNA的體內(nèi)翻譯效率,并有助于將mRNA標(biāo)記為相對(duì)于細(xì)胞內(nèi)免疫監(jiān)視機(jī)制的“自身RNA"。

ScriptCap1蓋帽系統(tǒng)提供了一種在IVT反應(yīng)中通過(guò)共轉(zhuǎn)錄蓋帽來(lái)制造蓋帽RNA的替代方案,在IVT反應(yīng)中,用二核苷酸蓋帽類(lèi)似物(例如m7GpppG)代替部分GTP,如果RNA的5‘末端不是結(jié)構(gòu)化的,使用ScriptCap 1蓋帽系統(tǒng)的蓋帽效率可以接近100%。相反,由于CAP類(lèi)似物與GTP競(jìng)爭(zhēng)RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng),共轉(zhuǎn)錄的蓋帽效率受到CAP類(lèi)似物的濃度及其與GTP濃度之比的限制。因此,在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用CAP類(lèi)似物蓋帽的RNA百分比總是小于100%。在使用CAP類(lèi)似物的共轉(zhuǎn)錄蓋帽反應(yīng)中可以產(chǎn)生的CAP RNA的量也受到降低GTP濃度以允許CAP類(lèi)似物競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)錄起始的需要的限制。另一方面,如果要蓋帽的RNA具有高度結(jié)構(gòu)的5‘末端,則與CAP類(lèi)似物共轉(zhuǎn)錄蓋帽可能是有益的。

優(yōu)勢(shì):靈活進(jìn)行cap0和cap1的加帽;

   效率*,接近100%;

   同類(lèi)產(chǎn)品可直接交叉使用以及價(jià)格合適。

應(yīng)用:進(jìn)行體外mRNA的修飾,用作體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)和生理試驗(yàn);

   前體mRNA的研究試驗(yàn)以及疫苗研究。



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